Die Lichtschicht-Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) hat sich als bahnbrechende Technologie in der biochemischen Forschung etabliert. Diese Methode ermöglicht Forschenden, wie Zeyu Zhang, eine dreidimensionale Ansicht auf fluoreszierende Proben, insbesondere auf Teile von lebenden Zellen, zu erhalten. Ein herausragendes Merkmal der LSFM ist die Verwendung der Technik der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC), die es ermöglicht, die Leuchtdauer von Molekülen in den Proben präzise zu messen. Dr. Meike Hofmann, wissenschaftliche Mitarbeiterin am Fachgebiet Technische Optik, hebt die Crucialität der Leuchtdauer für das Verständnis biologischer Prozesse hervor.
Das Mikroskopsystem erfasst Photonen und verfolgt deren Ankunftszeit sowie -ort. Diese präzisen Ergebnisse erfordern eine große Menge an Photonen, was analog dazu führt, dass viele Datenpunkte gesammelt werden müssen, um ein umfassendes Bild zu erzeugen. So berichten Experten von der natur.com, dass neueste Entwicklungen in der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (FLIM) das Potenzial bieten, die Komplexität biologischer Systeme in nie dagewesener Klarheit darzustellen.
Die Mechanik von FLIM
FLIM ist ein fluoreszenz-basiertes bildgebendes Verfahren, das die Lebensdauern angeregter fluoreszierender Moleküle anstelle der Fluoreszenzintensität misst. Der Vergleich zwischen der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie und FLIM zeigt die signifikanten Unterschiede in der Fluoreszenzlebensdauer, die wichtige Informationen über die molekulare Umgebung und Energieübergangsprozesse liefern. Eine Abnahme der Fluoreszenzlebensdauern kann beispielsweise auf Förster-Resonanzenergietransfer hinweisen, was für die Erforschung von Proteininteraktionen von Bedeutung ist.
Die fluoreszenzlebensdauer gibt die mittlere Zeit an, die ein Molekül im angeregten Zustand verweilt, bevor es in den Grundzustand zurückkehrt. Diese Lebensdauer ist umgekehrt proportional zur Summe der Zerfallsraten der strahlenden und nichtstrahlenden Prozesse. Aufgrund der Abhängigkeit der Fluoreszenzlebensdauer von der Identität und der chemischen Umgebung des Farbstoffs können Forschende mit dieser Methode präzise Bilder für jedes Pixel erzeugen.
Anwendungen und Innovationen
Die Messmethoden innerhalb der FLIM umfassen gepulste Anregung, bei der der zeitliche Fluoreszenzabfall analysiert wird, sowie intensitätsmodulierte Anregung mit Phasenverschiebung. Hierbei wird die Anregungsintensität so eingestellt, dass pro Puls nur ein Photon detektiert werden kann. Die Verwendung von Histogrammen aus Einzelmessungen ermöglicht es, die Fluoreszenzlebensdauer genau zu bestimmen.
Die technologischen Fortschritte, wie sie in der Forschung von Wikipedia beschrieben werden, umfassen die Integration von hochmodernen Bildsensoren wie CCD-Kameras und Avalanche-Photodioden-Feldern zur Detektion, sowie die Nutzung von ICCD-Kameras, die Bildverstärker zur Sensibilisierung verwenden. Diese Entwicklungen tragen entscheidend dazu bei, die Messgenauigkeit sowie die damit verbundenen Anwendungen in der Biomedizin und Molekularbiologie dramatisch zu verbessern.
